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1.3.3 GBRG降血糖作用研究

1.3.3.1 各组分GBRG对α-葡萄糖苷酶抑制活性的发芽分析测定

将各组分GBRG配成0.5mg/mL的溶液，取0.60mL磷酸缓冲液（0.05mol/LpH6.8）和0.20mLα-葡萄糖苷酶酶液（0.2U/mL）与0.10mL各组分GBRG液分别进行混合，糙米作为待测样品，糖蛋将样品37℃水浴10min后，白抗加入20mmol/L的炎降PNPG溶液0.20mL。5min后加入1mL1mol/L的血糖性Na2CO3溶液终止反应。对照组为阿卡波糖，发芽分析405nm处测定其吸光值，糙米并计算各组分GBRG对α-葡萄糖苷酶的糖蛋抑制率，筛选出抑制α葡萄糖苷酶的白抗活性最显著的糖蛋白组分进行后续研究。

1.3.3.2 具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的炎降GBRG组分的抑制率及半数抑制浓度的测定

将筛选出对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用最明显的GBRG组分溶解，配成1.00，血糖性0.50，发芽分析0.20，糙米0.10，糖蛋0.05，0.01mg/mL备用，按照1.3.2.1节所述方法，求出50%抑制率对应的α-葡萄糖苷酶抑制剂的浓度，即为GBRG组分的半数抑制浓度（IC50）。α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式为（1）。

式中：a—无样品α-葡萄糖苷酶溶液的吸光值；b—无样品也无α-葡萄糖苷酶的吸光值；c—有样品的α-葡萄糖苷酶混合溶液的吸光值；d—无α-葡萄糖苷酶样品的吸光值。

1.3.3.3 各组分GBRG对α-淀粉酶抑制活性的测定

用α-淀粉酶（2U/mL）溶液0.2mL各组分GBRG溶液（1mg/mL）在37℃预混合10min，以0.3mL5%的淀粉溶液为底物，孵育15min。加入2mLDNS试剂，100℃加热15min，测定其在540nm处的吸光度。试验重复3次，取平均值。

1.3.3.4 具有α-淀粉酶抑制作用的GBRG组分

对α-淀粉酶的抑制率及半数抑制浓度的测定选择对α-淀粉酶具有最明显抑制作用的GBRG组分配成0，0.2，0.4，0.6，0.8，1mg/mL溶液备用，按照1.3.2.3节所述方法，求出50%抑制率对应的α-淀粉酶抑制剂的浓度，即为GBRG组分的半数抑制浓度（IC₅₀）。α-淀粉酶的抑制活性计算公式为（2）。

式中：Ac—不加样品的α-淀粉酶溶液吸光度；A'c—不含样品和α-淀粉酶的吸光度；As—含样品但不含α-淀粉酶的吸光度；A's—无α-淀粉酶的样品溶液吸光度。

2 结果与讨论

2.1 GBRG的抗炎作用研究结果分析

2.1. 1不同GBRG组分对细胞增殖影响结果

MTT法测定不同浓度WEG、SEG-1和SEG-2糖蛋白组分对RAW264.7存活率的影响结果如图1所示。

由图1可知，糖蛋白在低浓度时，对经LPS诱导后的RAW264.7细胞生长并无抑制效果，细胞的存活率较高；在中浓度时，抑制的作用稍显提高，细胞的存活率下降，但基本高于对照组；高浓度时，抑制作用减弱，细胞存活率有所提升。结果表明：当糖蛋白溶液质量浓度在0.025～0.2mg/mL时，对RAW264.7细胞没有毒性且细胞存活率高于对照组

2.1.2 RT-PCR测定细胞因子TNF-α、COX-2、IL-1β和iNOS的表达结果

2.1.2.1 糖蛋白WEG对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达的影响

糖蛋白WEG对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达如图2所示。

由图2可知，与空白组相比，经1μg/mL的LPS诱导1d后，可以增加小鼠巨噬细胞RAW264.7iNOS、COX-2、TNF-α与IL-1βmRNA的相对表达水平（P＜0.01），其值分别为1.03，0.873，0.891与0.911。WEG和诱导后的RAW264.7细胞一起培养1d后，和LPS的对照组相比，低剂量组均可以调节iNOS、COX-2及IL-1βmRNA的相对表达水平，而中、高剂量组iNOS、COX-2和IL-1βmRNA的相对表达水平显著下降（P＜0.05），降至最低值各为0.571，0.549，0.544；对于炎症因子TNF-α，低、中、高剂量都可降低mRNA的相对表达水平，从0.648降至0.247，且呈剂量依赖关系。

2.1.2.2 糖蛋白SEG-1对LPS诱导得RAW264.7细胞炎症因子表达的影响

糖蛋白SEG-1对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达如图3所示。

由图3可知，与空白组相比，经1μg/mL的LPS诱导1d后，炎症因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1βmRNA的相对表达水平极显著上升（P＜0.01），分别达到1.341，1.387，0.871和0.915。低剂量的SEG-1对iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1βmRNA的相对表达水平有显著的降低作用（P＜0.05），分别降至0.967，1.053，0.72和0.693。中、高剂量的SEG-1对于IL-1β、TNF-α、COX-2和iN-OSmRNA的相对表达水平有极显著的作用（P＜0.01），尤其是在对TNF-α炎症因子上。各表达水平最低降至0.574，0.587，0.221和0.492。

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